Konstanz 1998 – scientific programme

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SYC: Symposium Einzelne Atome, Ionen und Moleküle

SYC 2: Symposium Einzelne Atome, Ionen und Moleküle II

SYC 2.4: Talk

Thursday, March 19, 1998, 12:00–12:30, R 711

Beobachtung der Reaktion individueller Moleküle im Lichtmikroskop — •K. O. Greulich, V. Uhl, B. Schäfer und G. Pilarczyk — Inst. f. Mol. Biotech., Postfach 100 813, D–07708 Jena

Die Beobachtung individueller fluoreszenzmarkierter biologischer Makromoleküle im Lichtmikroskop ist besonders einfach, da oft mehrere Fluorophore verfügbar sind. Daher ist, über die reine Beobachtung hinaus, das Studium von biochemischen Reaktionen möglich. Wenn z.B. ein Enzym ein nichtfluoreszierendes Molekül (zum Beispiel NAD*) in ein fluoreszierendes (zum Beispiel NADH) umsetzt, kann man den Reaktionsablauf anhand der entstehenden Fluoreszenz studieren. Zu diesem Zweck wird ein Mikrotropfen einer hochverdünnten Enzymlösung (z.B. Lactat - Dehydrogenase ) mit Hilfe eines Mikroinjektors in eine Lösung injiziert, die das nichtfluoreszierende NAH+ enthält. Die Konzentration ist so berechnet, daß der Mikrotropfen etwa 10–20 Enzymmoleküle enthält. An der Grenze zwischen Mikrotropfen und NAH+ Lösung kann es dann zu Reaktionen kommen. Es bilden sich fluoreszierende Stellen, deren Intensität mit der Zeit ansteigt. Hieraus kann die Reaktionsgeschwindigkeit ermittelt werden. Wenn sich für sich die gemessenen Geschwindigkeiten nur durch ganzzahlige Vielfache unterscheiden, kann man den kleinsten Wert einem einzelnen Enzymmolekül im Zentrum des Fluoreszenzspots zuordnen. In einer anderen wichtigen Reaktion der molekularen Biotechnologie schneidet ein Enzymmolekül ein DNA Molekül. Nach Fluoreszenzfärbung der DNS kann dieser Vorgang direkt bei Verwendung einer Einzelphoton-Zählkamera im Lichtmikroskop direkt beobachtet werden. Hierzu benötigt man aber zeitliche Kontrolle über die Reaktion, da beim Vormischen der Partner noch keine Reaktion ablaufen darf. Diese Kontrolle wird dadurch erreicht, daß die Reaktion photo–induzierbar gemacht wird und schließlich nach Abschluß aller Vorbereitungen durch Einstrahlen von UV–Licht gestartet wird.

[1] V.Uhl, G.Pilarczyk, K.O.Greulich 1997 Progress in Biomedical Optics, SPIE Proceedings Enzyme kinetics on a molecular level with optical microscopy

[2] C.Hoyer, S.Monajembashi, K.O.Greulich 1996 J.Biotech. 52.2, 65-73 Laser manipulation and UV induced single molecule reactions of individual DNA molecules